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    免疫荧光双标实验,哪一步最容易出错

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    免疫荧光实验作为最常见的实验之一,应用化学方法将荧光色素(主要是异硫氰酸荧光黄,fluorescein isoth iocyanate,FITC)与抗体结合起来,即荧光抗体,这种结合荧光色素的抗体的免疫原性并不因此而发生改变。


    实验原理:


    在特定条件下用其着染标本,如果标本中存在有相应的抗原,荧光抗体便与标本中的抗原发生特异性结合,在荧光显微镜的蓝紫光或紫外光照射下,标本中的抗原抗体复合物便发出特异的荧光,荧光的出现表明被检标本中特异抗原的存在;如果标本中不存在相应抗原,两者便不能结合,水洗时,荧光抗体便被洗掉,因而标本在荧光显微镜下观察不呈现特异荧光。因此,可以根据荧光的有无及强弱来判定抗原与抗体是否存在或相对应。


    那么常用的免疫荧光双标的实验过程是怎么样的呢,小编就带着大家简单的复习一下!


    (1)直接法双重免疫荧光标记:


    将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合,滴加在标本上孵育,然后洗去未结合的荧光抗体,在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察,即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠,但灵敏度较低。


    (2)间接法双重免疫荧光标记:


    用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞,洗去多余的第一抗体后,再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞,洗去多余的第二抗体,后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察,从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属,且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。


    实验注意事项: 


    1、荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h,时间过长,可能会使荧光提前衰退。


    2、每次试验均需设置以下三种对照:


    (1) 阳性对照:阳性血清+荧光标记物;


    (2) 阴性对照:阴性血清+荧光标记物;


    (3) 荧光标记物对照:PBS+荧光标记物。



    1、合适的细胞密度


    细胞密度是试验成功的第一步,细胞密度太大,会造成细胞过于拥挤而边界不清晰,不仅细胞形态不佳且易导致染色背景深。同理细胞过少时不仅容易贴壁不好观察时不好找细胞,而且由于细胞过少可能活性不佳从而易发生非特异性荧光染色。不管是用六孔板还是共聚焦皿细胞密度以达到75%-85%最佳。


    2、细胞固定和通透


    固定剂的选择依赖于抗原的亚细胞定位(膜蛋白,可溶,细胞骨架相关蛋白等)。3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛是最常用的固定剂,适用于绝大多数蛋白。如果是研究膜蛋白的话,最好用3.7%-4%的甲醛。而研究细胞骨架成分可用甲醇固定法。固定后一般需要通透步骤,通透即是在膜上打孔,让抗体更易进入细胞与抗原结合。


    选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透一般可以用0.1%-0.2%的Triton-X 100,而选择甲醇固定一般无需再通透,甲醇本身就有通透的作用。


    3、封闭条件的优化选择


    为了防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前用封闭液封闭,这样可以减少非特异性的背景着色。封闭液可以选择二抗来源一致的血清,一般来说,血清价格比较昂贵,可以用1%-5%BSA替代,BSA可以说是万能的封闭血清。另外封闭时间不易过长,30-60min即可,且封闭后不用洗涤,直接加一抗孵育即可。


    4、一抗二抗的选择


    封闭过后需要一抗孵育,可以选择4度过夜孵育或者室温3h,以笔者的经验是一抗孵育4度过夜比较好,抗原抗体结合会比较充分。一抗二抗的稀释比例可以根据抗体说明书来,再根据自己具体的实验要求进行优化。如果抗体浓度过低,会造成信号太弱,如果抗体浓度过高可能会造成背景染色太强。荧光二抗个人感觉Alex flour荧光基团信号强于Dylight强于FITC。如果做免疫双标,一抗要来自不同种属,荧光二抗的光谱也要分开。


    5、洗涤步骤


    免疫荧光过程中,有很多洗涤步骤,用PBS即可。在洗涤过程中,一要注意动作轻柔,固定后的细胞比较脆弱,如果太过大力,很容易把细胞吹洗掉,二是洗涤时间要把握好,每次洗涤5min左右,三是切忌不要干片,即吸掉溶液后不要把细胞干着,不然容易造成背景着色。



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