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    shRNA表达克隆的应用

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         基因表达下调 shRNA克隆对单个基因的基因表达抑制效应可以通过和一个包含不规则序列的阴性对照克隆来比较研究。


         信号通路研究 我公司的人类基因ORF克隆按照不同的信号传导、代谢、疾病通路和相关性、基因家族等进行了分类。将已知同一通路的shRNA克隆以96孔或384孔板的形式排列在一起,可一次研究一组基因在某一信号通路中的功能。目前我公司已可提供针对人类全部激酶基因的shRNA克隆,并已按照按不同激酶的功能进行了分类。


         ORF表达克隆确证 我公司已有shRNA相应人类靶基因的ORF克隆,可装在各种表达载体中,带有不同的标签和跟踪标记基因。这些正常的ORF表达克隆和在shRNA靶序列带有沉默突变的同样的ORF表达克隆,可以用于shRNA确认研究和基因功能拯救研究。


         OmicsLink? shRNA表达克隆的基因表达抑制效应的检测方法
         1.q-RT-PCR检测 shRNA的表达,能导致目的基因所转录的mRNA被切割和降解,从而降低蛋白的表达,所以推荐检测表达抑制效应的第一步是做q-RT-PCR。我公司提供确证过的对应目的基因的q-RT-PCR引物。


         2.Western blot检测 检测表达抑制效应,大部分都需要用Western Blot方法来检测所表达蛋白表达水平的下调。我公司提供2500多种单克隆抗体和针对人类蛋白的多克隆抗体。


         3.功能检测 检测表达抑制效应,还可通过生物和生化的终点分析方法,分析细胞增殖、克隆形成、细胞周期、细胞迁移等,根据目的基因具体的功能而定。


         4.跟踪标记基因或蛋白进行功能检测 当所研究基因的内源转录水平很低,并且/或者q-RT-PCR和WB检测不适宜的时候, 表达抑制效应也可通过共转导shRNA克隆和一个含目的基因并带了跟踪标记基因的表达克隆,跟踪标记基因所编码的报告蛋白可用于功能检测。靶基因的mRNA遭shRNA的破坏,就同时导致了跟踪标记基因的mRNA遭破坏,从而表现为报告蛋白的表达下降。这样,表达抑制效应就可以用报告蛋白的酶活性分析结果来进行量化。

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